Днк чипы. Белковые и пептидные чипы. Изготовление биологических чипов

Современные крошечные ДНК-чипы, заменяющие целые генетические лаборатории, способны «угадать мелодию», то есть определить ген, всего по нескольким нотам-молекулам. Для того, чтобы это стало возможным, учёным пришлось скрестить полупроводниковые технологии с биохимией.

Молодая калифорнийская компания Affymetrix (начавшая свою работу в 1993 году) — один из лидеров рынка приборов для генетических исследований.

Фирма известна своим революционным соединением технологий полупроводниковой, так сказать, «микросхемной», промышленности и биохимических экспериментов.

ДНК-чипы от Affymetrix широко используются в разных лабораториях, занятых генетическим анализом и генной инженерией.

Но обычным людям куда интереснее другой продукт компании. Это прибор, похожий на микросхему, позволяющий идентифицировать десятки ДНК от различных животных в образце человеческой пищи.

bioMerieux FoodExpert-ID фактически — разновидность так называемого GeneChip.

Прибор может идентифицировать биологические следы в пище от 12 разновидностей млекопитающих, 5 видов домашней птицы и 16 разновидностей рыбы.

Таким образом, он позволяет узнать, действительно ли гусиный паштет, вызывающий у покупателя подозрения, содержит гусиную печень, а не что-то ещё.

ДНК-чип создаётся по технологиям, сходным с компьютерными, но это не электронный, а биологический объект (иллюстрация с сайта affymetrix.com).

А, к примеру, мусульмане могут проверить — не положили ли недобросовестные изготовители свинину в «говяжьи» котлеты.

Всё это, правда, работает, лишь с привлечением дополнительных лабораторных возможностей, так что использовать чип в «голом» виде, на коленке, простому потребителю не удастся.

Чтобы понять, как работает FoodExpert-ID, нужно вспомнить самую малость из генетики: двойные спирали ДНК, составляющие их молекулы-основания — аденин, гуанин, тимин и цитозин, а также то, что они могут соединяться только попарно, словно ключи и замки.

ДНК-чип содержит мириады и мириады «располовиненных» фрагментов ДНК-кода.

Фрагмент поверхности чипа с молекулами-ключами (иллюстрация с сайта affymetrix.com).

Поверхность чипа размером с ноготь разделена на 97 тысяч квадратиков, названных «особенностями».

Каждая «особенность» поперечником приблизительно 26 микронов содержит лишь один ДНК-код. Точнее много-много одинаковых молекул.

И все они однозначно относятся к одному из 33 животных.

Длина каждого фрагмента — 17 оснований. Этого достаточно для надёжной идентификации, как достаточно 17 взятых подряд в любом месте нот, чтобы определить какую-нибудь мелодию из имеющейся базы данных.

Целую россыпь разбитых кусочков ДНК экспериментаторы выделяют из образца пищи. Чего там только нет. А чего?

«Неправильные» фрагменты генетических кодов смываются, а совпадающие — закрепляются на чипе. Красные шарики — флуоресцентные молекулы (иллюстрация с сайта affymetrix.com).

Добавим к молекулам, составляющим генетический код, молекулы флуоресцирующего вещества. Нанесём эту смесь на поверхность FoodExpert-ID. Осталось сделать немного.

Все совпадающие фрагменты кода соединятся со своими «родными» последовательностями в той или иной «особенности».

Теперь чип можно промыть водой — всё лишнее уйдёт. Чип помещают под луч лазера, и квадратики, содержащие отловленный материал будут ярко светиться. Осталось лишь свериться с картой чипа, чтобы узнать — какие ДНК определены.

А по интенсивности свечения можно сделать косвенный вывод и о пропорциях свинины и говядины в нашей гипотетической котлете.

Как видим, использование чипа сравнительно несложно, и позволяет заниматься генетическим анализом лабораториям, имеющим весьма простой набор оборудования.

Но насколько же хитроумно производство чипа. Чтобы создавать такие биохимические шедевры автоматизировано и в массовом порядке, Affymetrix соединила принципы фотолитографии и комбинаторной химии.

Цветные квадратики — «особенности», отвечающие за идентификацию того или иного ДНК-кода (иллюстрация с сайта affymetrix.com).

Исходный продукт — кварцевая пластина — покрывается специальным реактивом, силаном, который прочно соединяется с кварцем и формирует строго периодичную молекулярную матрицу (с равномерной поверхностной плотностью), готовую принять нуклеотиды.

В цепочках будущего кода основания идут вертикально вверх, а наносят их одновременно на всю поверхность, слой за слоем.

Разумеется, каждый раз на чип подают определённое вещество, и чтобы оно закрепилось только в определённых «особенностях», тех самых микронных квадратиках, используют маски, аналогичные тем, что нужны для производства микросхем.

Снимок прореагировавшего чипа с большим увеличением. Белые, красные, жёлтые квадратики — участки с высокой концентрацией флуоресцентного вещества. Зелёные, синие, чёрные — соответственно, со всё более и более с низкой (иллюстрация с сайта affymetrix.com).

С основой чипа каждый раз сцепляются лишь те основания, что освещаются через отверстия в маске ультрафиолетом.

В этом процессе последовательного синтеза главное — каждый раз накладывать новую маску с микронной точностью, иначе все генетические коды на пластине перемешаются.

Так, шаг за шагом (в пищевом чипе их 17, в других моделях фирмы — до 24) формируются вертикальные столбики нуклеотидных цепей, которые и создают ключи-анализаторы генов.

Эта технология служит, конечно, не только для таких забавных (на первый, возможно, взгляд) областей применения, как выявление мяса поросёнка в гусином паштете, но и для вполне серьёзных научных исследований.

Ведь на поверхность чипа, теоретически, можно нанести фрагменты каких угодно генетических кодов.

Работа Affymetrix — лишнее доказательство, что самые интересные и перспективные открытия происходят на стыках наук и дисциплин.

Похоже на биологическое разнообразие в природе, получаемое смешением генов. Не так ли?

Экспрессия генов - это процесс, в ходе которого наследственная информация от гена (последовательности нуклеотидов ДНК) преобразуется в функциональный продукт - РНК или белок. Регуляция экспрессии генов позволяет клеткам контролировать собственную структуру и функцию и является основой дифференцировки клеток, морфогенеза и адаптации.

ДНК–чипы представляют собой уникальный аналитический инструмент, позволяющий определять наличие в анализируемом образце (как правило, биологического происхождения) заданных последовательностей ДНК (т.н. гибридизационный анализ). Проведение анализа с помощью ДНК–чипов обходится в несколько раз дешевле, чем при использовании альтернативных технологий (электрофорез, ПЦР в реальном времени) и допускает, при наличии детектора несложной конструкции, работу вне лаборатории.

Впервые ДНК–чипы были использованы в исследованиях в конце 80-х годов прошлого века. В основе этого теперь уже широко распространенного метода, позволяющего одновременно анализировать экспрессию множества генов, лежит принцип узнавания мРНК-овых или кДНК-овых мишеней посредством их гибридизации с иммобилизованными на микрочипе одноцепочечными фрагментами ДНК. Современный ДНК-микрочип состоит из тысяч дезоксиолигонуклеотидов (зондов, или проб), сгруппированных в виде микроскопических точек и закреплённых на твёрдой подложке. Каждая точка содержит несколько пикомолей ДНК с определённой нуклеотидной последовательностью. Олигонуклеотиды ДНК-микрочипа могут быть короткими участками генов или других функциональных элементов ДНК и используются для гибридизации с кДНК или мРНК (кРНК). Гибридизация зонда и мишени регистрируется и количественно характеризуется при помощи флюоресценции или хемилюминесценции, что позволяет определять относительное количество нуклеиновой кислоты с заданной последовательностью в образце.

В обычном ДНК-микрочипе зонды ковалентно прикрепляются к твёрдой поверхности - стеклянному или кремниевому чипу. Другие платформы, например, выпускаемые Illumina, используют микроскопические шарики вместо больших твёрдых поверхностей.

ДНК-микрочипы используют для анализа изменения экспрессии генов, выявления однонуклеотидных полиморфизмов, генотипирования или повторного секвенирования мутантных геномов. Микрочипы отличаются по конструкции, особенностям работы, точности, эффективности и стоимости.

ДНК-микрочипы:

КДНК-микрочипы

oлигонуклеотидные

(двукрасочные с флуоресц. детекцией)

олигонуклеотидные

(Affymetrix, однокрас. с флуоресц. детекцией)

мембранные к-ДНК-микрочипы

(с радиоакт. детекцией)

Гелевые к-ДНК-чипы

Белковые микрочипы

Немного истории

1980-е: белковые чипы

~1991: химия синтеза ДНК на подложке (высокой плотности) – олигонуклеотидные чипы Affymetrix (Fodor, Stryer, Lockhart)

~1995: роботы для микрораскапывания – кДНК чипы Stanford University (Pat Brown and Dari Shalon)

1990-е: гелевые чипы ИМБ

Однако, еще в 1982 Augenlicht и Kobrin предложили DNA array (Cancer Research ), а в 1984 они сделали чип, включающий 4000 элементов для исследования раковых клеток.

(Статья была отклонена Science и Nature )

Что можно изучать с использованием ДНК-микрочипов?

Экспрессию генов в различных тканях

Экспрессию генов в норме и при патологии (в нормальных и раковых клетках)

Изменение экспрессии генов с течением времени как результат внешнего воздействия (взаимодействие клетки с патогеном, лекарством)

Профили экспрессии (паттерны) различаются у нормальных и раковых клеток или при различных типах рака. Излечимые и неизлечимые виды лейкозов дают разные паттерны. По виду паттернов можно с большой вероятностью предсказать течение болезни на самой ранней стадии.

Экспрессионные микрочипы

Одно из активно разрабатываемых направлений с применением технологии микрочипов – это исследование транскрипционных профилей при сложных заболеваниях. Хотя все клетки нашего организма обладают одной и той же переданной по наследству геномной ДНК, каждая клетка экспрессирует различные гены в виде мРНК в соответствии с типом клетки, биологическими процессами, нормальным или патологическим состоянием и т.д. Это разнообразие в профилях генной экспрессии является предметом интенсивного изучения ввиду его биологического и клинического значения. Способность технологии микрочипов анализировать экспрессию сотен и тысяч генов оказалась наиболее востребована при расшифровке такого сложного заболевания, как рак. Технология микрочипов позволяет одновременно отслеживать экспрессию десятков тысяч генов, создавая молекулярный портрет клетки. К наиболее значительным последствиям изучения профилей генной экспрессии можно отнести диагноз, стратификацию и определение прогноза при многих видах рака. Хотя гистопатологическая оценка, дополненная цитогенетическим исследованием и анализом нескольких молекулярных маркеров, все еще является золотым стандартом в постановке диагноза и определении прогноза, работы последних лет показывают, что во многих случаях она может быть заменена определением профиля экспрессии генов. Диагноз и прогноз при раковых заболеваниях требуют совместной экспертизы нескольких специалистов-практиков, таких как онкологи, патологи и цитогенетики, кроме того, окончательные выводы могут варьировать в зависимости от методических подходов и квалификации экспертов. Микрочипы могли бы полностью заменить усилия многих специалистов, кроме того, повысить точность в постановке диагноза и определении прогноза, а также обеспечить единую стандартизированную платформу для анализа.

Для анализа экспрессии генов используют микрочипы двух типов: на основе комплементарной ДНК (кДНК) и на основе олигонуклеотидных зондов. Микрочипы на основе кДНК представляют собой фрагменты ДНК, закрепленные на поверхности стандартных микроскопических стекол или на другой твердой подложке. В олигонуклеотидных микрочипах на такой же подложке иммобилизованы олигонуклеотиды длиной 25–60 нуклеотидных оснований (н.о.). Процедура подготовки образца при проведении анализа на микрочипах представлена на рис. 2. Из клеток выделяют тотальную РНК (иногда выделяют также фракцию мРНК), далее проводят реакцию обратной транскрипции, используя комбинированный праймер, содержащий последовательность, комплементарную полиА-концевому фрагменту мРНК, и участок промотора Т7 РНК-полимеразы. Включение в состав синтезирующейся цепи кДНК последовательности промотора Т7 РНК-полимеразы позволяет в дальнейшем провести реакцию амплификации in vitro: фермент Т7 РНК-полимераза нарабатывает в пробирке множество копий РНК с каждой молекулы кДНК. Так происходит линейная амплификация исходной мРНК. Как правило, одновременно проводят мечение образующихся молекул РНК за счет использования в реакции нуклеотидов, содержащих флюоресцентную метку. В экспериментах с олигонуклеотидными микрочипами часто используют для мечения образца комплементарной РНК (кРНК) флюоресцентную метку одного типа, а уровни экспрессии генов определяют, сравнивая получаемые флюоресцентные сигналы с сигналами внутренних контрольных точек микрочипа. При работе с микрочипами на основе кДНК, как правило, в эксперименте используют 2 образца: контрольный образец метят одним флюоресцентным красителем, исследуемый образец – другим, далее их смешивают и гибридизуют с одним микрочипом. По соотношению двух разных флюоресцентных меток в каждой ячейке микрочипа судят о повышении или понижении уровня экспрессии данного гена. Независимо от технологической платформы в каждом эксперименте формируются данные, содержащие оценку уровня экспрессии десятков и сотен тысяч генов. Для обработки такого количества данных используется довольно сложный математический аппарат, в первую очередь, кластерный анализ. Анализ данных, полученных с помощью микрочипов, может производиться в сопоставлении с клиническими данными (анализ, ориентированный на проверку гипотезы, supervised analysis) или безотносительно к любой клинической характеристике пациента (независимый анализ, unsupervised analysis).

Классические методы позволяют проводить анализ экспрессии нескольких генов одновременно, либо требуют применения специализированных микрочиповых технологий, например, таких как Affymetrix . Affymetrix использует комбинацию фотолитографии и химического синтеза олигонуклеотидов для производства GeneChip® микрочипов.

YELLOW - если ген экспрессируется и в больной (Cy5) и в нормальной (Cy3) тканях, то в данном пятне будет гибридизоваться ДНК, меченная и красной и зеленой красками, и в результате получится желтый цвет

RED - если ген экспрессируется только в больной (Cy5) ткани, то в данном пятне будет гибридизоваться только ДНК, меченная красной краской

GREEN - если ген экспрессируется только в здоровой (Cy3) ткани, то в данном пятне будет гибридизоваться только ДНК, меченная зеленой краской

BLACK – если ген не экспрессируется ни в больной, ни в здоровой ткани

Таким образом,

ДНК-микрочипы позволяют одновременно анализировать информацию об экспрессии многих тысяч генов.

Основными типами использующихся в настоящее время ДНК-микрочипов являются кДНК-микрочипы и олигонуклеотидные чипы фирмы Affymetrix.

кДНК-микрочипы основаны на гибридизации смешанных экспериментального и контрольного образцов, меченых различными флуоресцентными красками, к чипу, на поверхность которого нанесены двунитевые к-ДНК, соответствующие ~10000-20000 генам.

Микрочипы Affimetrix основаны на гибридизации меченой биотином кРНК экспериментального образца с набором Perfect Match и Mismatch олигонуклеотидов, синтезированных на подложке чипа, с последующей прокраской стрептавидином-фикоэритрином. GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 позволяет одновременно анализировать 47000 транскриптов, среди которых 38500 охарактеризованных генов. Микрочип включает 1.300.000 олигонуклеотидов различных типов.

Анализ полученных данных требует многоэтапной математической обработки с использованием специальных статистических методов.

В практическом отношении применение микрочипов уже сегодня позволяет решать следующие задачи:

точная постановка диагноза, выявление новых подтипов заболевания, уточнение классификации;

прогнозирование течения болезни и клинического исхода, выявление генов и сигнальных путей, вовлеченных в патогенез онкогематологических заболеваний, поиск новых мишеней для направленной дифференцированной терапии;

разработка и создание более простых и дешевых диагностических тестов, в том числе и на основе технологии микрочипов (микрочипы, содержащие пробы на десятки или сотни генов вместо десятков и сотен тысяч);

включение микрочипов в проспективные клинические исследования, подтверждение результатов анализа на микрочипах для внесения в клинические протоколы лечения, дизайн клинических протоколов с учетом новых данных о природе заболеваний, полученных с помощью технологии микрочипов.

Позволяют анализировать огромное число генетических особенностей в одном образце исходного материала. При этом желательно, чтобы ДНК-чипы обладали двумя свойствами, которые в некотором смысле противоречат друг другу. С одной стороны, интересно в одном ДНК-чипе иметь как можно больше ячеек, чтобы получить больше информации об изучаемом образце. В то же время, исследователи зачастую вынуждены работать с очень малыми объемами биологического материала, поэтому чем меньше размер ДНК-чипа, тем лучше.

Современные методы (например, атомно-силовая микроскопия, AFM) позволяют детектировать сигнал в ячейках ДНК-чипа, когда их размеры составляют несколько десятков нанометров. Методы производства таких ДНК-чипов основаны на литографии (наиболее привлекателен метод dip-pen нанолитографии, DPN). Создание чипов со столь маленькими ячейками обычно весьма дорого и занимает много времени.

Группа ученых из США и Кореи предложила способ более дешевого, быстрого и массового производства ДНК-микро- и наночипов. Исследователи показали, что, взяв один ДНК-чип в качестве образца, можно за один шаг отпечатать чип, комплементарный исходному. Такой способ получения ДНК-чипов назван методом супрамолекулярной нанопечати (supramolecular nanostamping, SuNS) и схематически представлен на рисунке 1.

В качестве образца ученые взяли массив из одноцепочечных ДНК, пришитых к наночастицам золота, в котором размер ячейки составлял 9±2 нм, а расстояние между ячейками 77±9 нм. К этому ДНК-чипу добавили комплементарную ДНК, модифицированную гексилтиолом на 5’-конце. После гибридизации (то есть связывания комплементарных цепей ДНК) на чип-образец поместили стеклянную подложку, покрытую золотом. Комплементарные цепи ДНК присоедились к этой новой подложке. Затем при 90 °С была осуществлена дегибридизация, и в итоге получен отпечаток, комплементарный исходному образцу.

Исследовав полученную копию, ученые пришли к выводу, что отпечаток сделан успешно: на новом ДНК-чипе имелись ячейки размером 14±2 нм, разделенные 77±10 нм промежутками (рисунок 2). Чтобы показать, что расположение ячеек в массиве одинаково для образца и отпечатка, была рассчитана функция радиального распределения для обоих случаев (рисунок 3). Видно, что функции получились довольно похожи.

В дальнейшем необходимо показать, что SuNS пригодна для печати многокомпонентных чипов и для производства многих копий с одного образца без потери точности. Исследователи верят, что смогут продемонстрировать это в ближайшем будущем.

Работа «Application of supramolecular nanostamping to the replication of DNA nanoarrays» напечатана в журнале Nano Letters .

В последнее время активно развиваются ДНК-технологии, которые позволяют не только определять признак, но и одновременно проводить дифференциальный сиквенс, т.е. определение точечных мутаций или полиморфизма в известных участках генома. Данные технологии имеют значительные преимущества перед традиционными молекулярно-биологическими методами, т.к. они позволяют миниатюризировать исследуемый образец и анализатор, что значительно снижает стоимость анализа и время его проведения, а также одновременно определять различные параметры исследуемого образца, причем без потери чувствительности амплификационных методов. Главным преимуществом методов основанных на использовании чипов с олигонуклеотидами всех возможных нуклеотидных последовательностей данной длины, является их универсальность. Наличие на чипе олигонуклеотида любой последовательности делает возможным анализ любой исследуемой последовательности. В основе применения микрочипов лежит принцип быстрого определения взаимодействий тех или иных лигандов со множеством различных зондов одновременно. Собственно биологические микрочипы представляют собой ту или иную твердую подложку, на которой нанесены или определенные фрагменты нуклеиновых кислот, или белки, или углеводы, или какие-либо иные молекулы-зонды, способные быть узнанными или проявлять биологическую активность. Количество различных зондов на подложке может достигать сотен тысяч, причем чипы каждого типа строго идентичны и при существующих технологиях могут быть реплицированы в сотнях тысяч и миллионах копий нанесенных на подложку.

ДНК-микрочипы

Существуют белковые, ДНК, углеводные, тканеые чипы. Особого внимания заслуживают ДНК-чипы. Они представляют собой уникальный аналитический инструмент, позволяющий определять наличие в анализируемом образце (как правило, биологического происхождения) заданных последовательностей ДНК (т.н. гибридизационный анализ). Проведение анализа с помощью ДНК–чипов обходится в несколько раз дешевле, чем при использовании альтернативных технологий (электрофорез, ПЦР в реальном времени) и допускает, при наличии детектора несложной конструкции, работу вне лаборатории.

Впервые ДНК–чипы были использованы в исследованиях в конце 80-х годов прошлого века. В основе этого теперь уже широко распространенного метода, позволяющего одновременно анализировать экспрессию множества генов, лежит принцип узнавания мРНК-овых или кДНК-овых мишеней посредством их гибридизации с иммобилизованными на микрочипе одноцепочечными фрагментами ДНК.

ДНК–чип – это твердая подложка, на которой иммобилизованы (как правило, ковалентно) однонитевые фрагменты ДНК разной длины: короткие – 15-25 нуклеотидов, длинные – 25-60 нуклеотидов и кДНК фрагменты – от 100 до 3000 нуклеотидов. В качестве материала подложки используют стекло, кремний, различные полимеры, гидрогели (например, на основе полиакриламида) и даже золото.

Гибридизация-основа технологии

Основа всех современных ДНК-технологий – гибридизация. В результате гибридизации молекулы нуклеиновых кислот способны формировать устойчивые двухцепочечные структуры благодаря связям между элементами молекул - нуклеотидами. Нуклеотид аденин (А) комплиментарен тимину (Т), гуанин (Г) - цитозину (Ц). В результате одноцепочечная последовательность нуклеотидов АТГЦ будет образовывать стабильную ассоциацию, двухцепочечную структуру, с одноцепочечной молекулой ДНК состава ТАЦГ.

….. АТГЦ….

| | | |

….. ТАЦГ….

Подобная комплементарность приводит к «слипанию» двух молекул ДНК, одна из которых может быть неподвижно закреплена на подложке, и являться элементом ДНК-чипа. Чем больше содержится в образце молекул комплиментарных элементам чипа, тем больше их будет связываться с чипом, и тем выше будет интенсивность сигнала, воспринимаемого от данного элемента. На рис. 1 показан принцип действия ячейки ДНК или олигонуклеотидного биочипа, основанный на комплементарных взаимодействиях основания аденина (А ) с тимином (Т ) и гуанина (G ) с цитозином (С ) в двух нитях ДНК. Если последовательность оснований в одной нити ДНК (или олигонуклеотида) полностью комплементарна последовательности другой нити, то образуется стабильная совершенная двухнитчатая спираль - дуплекс. Однако присутствие в дуплексе даже одной неправильной пары, например G-G , предотвращает образование дуплекса. Если иммобилизовать в одном из элементов микрочипа специфическую одноцепочечную ДНК или, положим, 20-мерный олигонуклеотид (пробу), то при добавлении к микрочипу меченных флюоресцентными красителями фрагментов ДНК, например генома человека, будет происходить их высокоспецифичное взаимодействие. Заданный олигонуклеотидный элемент биочипа специфически свяжет только одну комплементарную последовательность из 4 20 =1.09х10 12 всех возможных последовательностей этой длины в ДНК. В результате флюоресцентное свечение наблюдается только на этом комплементарном элементе биочипа. Таким образом, один элемент биочипа производит одну выборку примерно из триллиона возможных вариантов, в отличие от элемента электронного чипа, где происходит двоичная выборка: ДА или НЕТ .

Рис. 1. Схема образования двойной спирали ДНК на биочипе. Олигонуклеотид фиксирован на одном из элементов биочипа и избирательно связывает из многих флуоресцентно меченых фрагментов ДНК только комплементарный. В результате только этот элемент начинает светиться. Это происходит благодаря высоко-специфичным взаимодействиям комплементарных пар нуклеотидов А с Т и G с С. Присутствие некомплементарной пары, например G-G , предотвращает взаимодействие и оставляет элемент микрочипа темным.

Используемые для определения параметров гибридизации устройства позволяют регистрировать не только конечный результат, но и кинетику ассоциации и диссоциации комплементарных цепей. Эти технологии, делая возможным многопараметрический анализ образцов, могут предоставлять большое количество информации. Результаты гибридизации зависят от длины ДНК - пробы, химического состава меченой ДНК - мишени, температуры, при которой проводится гибридизация, состава гибридизационной смеси, типа флуоресцентной метки. Здесь необходимо отметить, что в ДНК-чипах в основном используется пассивная гибридизация, т.е. взаимодействие ДНК-мишени с иммобилизованной пробой является вероятностным процессом и зависит от различных условий.

Применение ДНК-чипов

Оценка состояния и идентификация всех генов исследуемого организма является одной из важнейших задач, поставленных перед разработчиками ДНК-чипов. Решение этой задачи может быть реализовано в иммобилизации всех генов организма на биологический чип, что позволит комплексно оценить состояние генов и генома в целом. Биогенетические базы данных, содержащие всю информацию (систематизированную) по генам и геномам различных организмов, представляют исследователям огромные возможности в дизайне ДНК-чипов.

К основным причинам широкого распространения биочиповых исследовианий относят высокую чувствительность, специфичность и воспроизводимость, простоту процедуры выполнения, возможность одновременного анализа множества параметров и относительно невысокую стоимость работ. Эти же причины заставляют рассматривать биочипы как перспективный инструмент в различных областях народного хозяйства.

Подводя некоторые итоги нужно отметить, что микрочипы являются эффективным подходом для одновременной идентификации от десятков до тысяч генов и их структурного анализа, для выявления специфичных нуклеотидных последовательностей и нуклеотидных вариаций в их структуре. Однако, когда гены присутствуют в геноме в количестве одной или нескольких копий, с чем постоянно и приходится сталкиваться в клинической практике, требуется их предварительная амплификация. Наиболее эффективным методом амплификации ДНК является полимеразная цепная реакция, в процессе которой происходит экспоненциальное увеличение количества молекул ДНК от нескольких до миллионов и более копий, а основное достоинство такого вида ПЦР как Real Time, позволяют давать даже количественную оценку исследуемой матрицы. Это имеет важное значение для решения задач в области развития фундаментальных и интегральных наук, а так же оптимизации условий методов диагностики.

Итак, два метода, ставшие уже традиционными для некоторых областей науки и прикладных технологий, на ряду со своими недостатками имеют совершенно уникальные достоинства.

RealTime ПЦР:

· дает возможность оценивать количество исходной матрицы;

· не требует дополнительных трудоемких этапов работы;

· отсутствие стадии электрофореза позволяет минимизировать риск контаминации и таким образом уменьшить число ложноположительных результатов;

· использование математических методов анализа позволяет проводить автоматическую интерпретацию полученных результатов и снимает проблему субъективной оценки электрофореграмм;

· обеспечивает менее строгие требования к организации ПЦР-лаборатории и автоматической регистрации и интерпретации результатов;

· позволяет экономить время.

Биологические микрочипы:

· позволяют миниатюризировать образец и анализатор;

· экономит время и стоимость анализа;

· позволяет одновременно определять несколько параметров исследуемого образца;

· убладает высокой чувствительностью амплификационных методов, специфичностью и воспроизводимостью;

· обеспечивает простоту процедуры выполнения работы.

Возможно, что объединие этих методов за счет перевода полимеразной цепной реакции в формат микрочипов позволит создать диагностическую систему нового поколения, которую будут характеризовать следующие качества: более высокая чувствительность и, главным образом, специфичность определения нуклеиновых кислот, высокая производительность при низкой себестоимости выполнения анализа, общее сокращение количества манипуляций в пределах каждого этапа анализа.

) — миниатюрная пластина с нанесенными на нее в определенном порядке фрагментами известной последовательности для проведения генетического анализа.

Описание

ДНК-микрочип - устройство, созданное по аналогии с электронными микросхемами (чипами), предназначенное для одновременного выявления множества определенных последовательностей ДНК. ДНК-микрочип используется для изучения экспрессии генов и поиска мутаций в биомедицинских исследованиях. Микрочип изготавливается из стекла, силикона или пластика. ДНК наносится на него методом машинной микропечати и химической пришивки в виде множества упорядоченных точек, каждая из которых содержит равное количество синтезированных ДНК-фрагментов, имеющих уникальную последовательность. В других технологиях гибридизационного анализа генов комплементарные фрагменты ДНК пришивают к микроскопических шариков. Современные ДНК-микрочипы могут одновременно измерить экспрессию десятков тысяч генов у человека и выявить около миллиона мутаций. Принцип работы микрочипа для изучения экспрессии генов состоит в следующем. Активная работа гена в данной ткани выражается в накоплении его матричной (мРНК). Все мРНК экстрагируются из образца ткани, и с помощью фермента обратной транскриптазы на них синтезируется так называемая комплементарная ДНК (кДНК), которая значительно устойчивей и удобней в работе, чем мРНК. Полученный набор кДНК метят с помощью флуоресцентных или радиоизотопных меток.

Содержание индивидуальных кДНК в образце прямо пропорционально содержанию их мРНК-матриц и, следовательно, уровню активности соответствующих генов. Смесь кДНК наносят на микрочип, в каждой точке которого пришиты ДНК-фрагменты, соответствующие кодирующей последовательности одного из генов. кДНК находят «свои» точки и связываются (гибридизуются) с ними по принципу комплементарности. Чем больше в растворе кДНК данного вида, тем больше ее прикрепляется к своей точке. Затем специальное сканирующее устройство определяет содержание кДНК в каждой точке микрочипа, а программа соотносит его с названием гена, представленного данной точкой. Результатом ДНК-микрочипового исследования является матрица из точек, интенсивность которых прямо пропорциональна активности соответствующих генов.

Иллюстрации

Авторы

• Народицкий Борис Савельевич
• Ширинский Владимир Павлович
• Нестеренко Людмила Николаевна

Источники

1. DNA Chip Technology / Office of Science Education and Outreach: Research Technique Fact Sheets URL: http://www.genome.gov/DIR/VIP/Learning_Tools/Fact_Sheets/dna_chip.html (дата обращения 12.10.2009)
2. Ke Y., Stuart L., Yung C., Yan L., Hao Y. Self-assembled water-soluble nucleic acid probe tiles for label-free RNA hybridization assays.// Science – № 5860 (319), 2008 – P.180-183